免染成像技术

使用免染技术的优势

与考马斯染料相比，免染技术提供了更高的灵敏度和更好的动态范围

免染凝胶获得的蛋白质可视化数据与其他染料染色的凝胶数据具有可比性。一般来说，免染凝胶的灵敏度与考马斯亮蓝染色相近。对于色氨酸含量较高的蛋白质 ，免染比考马斯亮蓝染色具有更高的灵敏度（图 1）。

图 1. 免染凝胶、CBB R-250 和 Bio-Safe G-250 染色凝胶图像的比较。宽范围未染色分子量标准品的梯度 1:2 稀释液分离于 4–20% 的 Criterion Stain Free Tris-HCI Gel。免染胶成像采用具有免染功能的成像仪。然后再用考马斯亮蓝（CBB R-250 和 Bio-Safe G-250）对胶进行染色，并在光密度计上成像。箭头指示β - 半乳糖苷酶。
 

检出限免染胶为 8 至 28 ng，接近于银染（0.6–1.2 ng），而 考马斯 R-250 染料检出限为 35–50 ng 。一些荧光染料具有 1–0.5 ng 蛋白的检出限。免染与考马斯亮蓝或银染凝胶相比，具有更高的可重复性数据和较小的变异系数（McDonald 等，2008；McDonald，2009）。

蛋白质定量的线性动态范围定义为印迹上的信号强度随蛋白质加样的增加而成比例增加的范围。理想情况下，蛋白质加样量应落在定量线性动态范围内（Taylor 和 Posch，2014）。免染凝胶可在较宽的蛋白质加样范围（图 2A、图 2B）内提供良好的线性动态响应（来自细胞或组织裂解液，总蛋白质加样为 1-80 µg）（Taylor et al.，2013；Hammond et al.，2013）。

图 2. 线性动态范围 免染技术用于总蛋白质测量。A. HeLa 细胞裂解稀释液上样，80–2.5 µg 总蛋白；B. 细胞裂解稀释液上样，20–1 µg 总蛋白。

与下游实验的兼容性

考马斯染料与蛋白免疫印迹或质谱分析不兼容。当需要对凝胶中的蛋白质进行免疫印迹显色或质谱鉴定时，特别是大量样品需要进行凝胶分离与染色时，就必须平行跑多块凝胶。与考马斯染色不同， 免染技术与大多数下游实验兼容，例如蛋白免疫印迹，这不仅在样品有限的情况下无需跑多块胶，而且在使用总蛋白质归一化方面对数据的准确性也有帮助（请参见下面的定量蛋白免疫印迹中的内参归一化）。

蛋白质转印验证

蛋白质正确转移到膜上对于蛋白免疫印迹过程至关重要。验证蛋白质转移的一种常见做法是用丽春红 S对印迹膜进行染色，丽春红 S是一种带负电荷的染料，可与蛋白质中所有带正电荷的氨基酸结合。丽春红 S 染色快速且便宜，此外被染色的膜可用于下游实验，如蛋白免疫印迹。但是，染料与蛋白质结合的短暂特性导致膜上条带的强度迅速降低，从而使检测和定量变得更加困难。其他相对昂贵的印迹染料，例如 SYPRO Ruby 或酰胺黑，也用于印迹定量，需要特殊的处理方法。查看印迹上的染色所需的时间也随所用染料的不同而不同。使用丽春红染色剂的方案建议至少染色 5 分钟，然后清洗 15 分钟。SYPRO Ruby 印迹染色较为精细，需要固定、隔夜染色和脱色。

验证蛋白质从凝胶转移到膜上的效率，采用免染成像仪为蛋白免疫印迹提供了可观的时间和成本节省（Colella 等，2012）。观察到的条带强度不取决于染色或脱色的持续时间，这是在可视化和定量过程中的一个重要因素。另外，条带强度不会随时间降低，这是由于共价修饰的结果。使用免染方法，可以在短暂的 2 分钟内验证蛋白质的转印效率。

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  转印前凝胶

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  转印后的膜

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  转印后凝胶

评估蛋白质转印 使用免染成像系统评估转印效率。使用 Stain-Free 成像仪拍摄转印前后的凝胶和转印后的膜图像。将血红蛋白的 1:2梯度稀释液（起始量为 80 ng），与 1.8 µg BSA/泳道一起电泳（上面条带为BSA），在 4–20% 的 26 孔 Criterion Stain Free 凝胶上进行电泳分离。

常见问题

问题：我是否需要购买新的缓冲液和试剂才能使用免染技术？

回答：免染凝胶不使用专门的缓冲液或试剂。可以使用标准的 SDS-PAGE 缓冲液。然而，该技术确实需要能够激活染料并可视化的成像仪。查看我们的免染成像系统。

问题：由于免染技术利用色氨酸残基进行化学偶联，是否影响我对总蛋白的检测？

回答：从理论上讲，即使只有一个色氨酸残基也足以激活信号，并且可以轻松检测和定量只有两个色氨酸残基的蛋白质。对于大多数应用，色氨酸残基用于可视化的要求不是问题。UniProt 数据显示所有物种所含的蛋白质中只有约 10% 缺乏色氨酸，且大多数蛋白质的大小都小于 10 kD。在大多数生物中，大约 90% 的蛋白质大小超过 10 kD（在 10–260 kD 范围内）并具有色氨酸残基（表 1）。

表 1. 几种模型生物的预测蛋白质组的色氨酸含量。*

免染和 Bio-Safe G-250 染色凝胶上蛋白质的检出限 (LOD) 和定量限 (LOQ)。条带来自宽范围未染蛋白标准品，四个重复凝胶的样品平均值用于确定 LOD 和 LOQ。

问题：免染如何影响我们今天进行蛋白免疫印迹实验的方式？​

回答：由于使用管家蛋白及相关归一化问题引起的定量错误越来越多，由此导致的期刊撤稿案例也陆续发生，作者要么发行勘误，要么被拒绝发表（Neill 2009）。现在，期刊要求严格遵守使用内参的标准，并要求使用可产生线性动态范围的成像技术（请参见生命科学研究报告指南，自然出版集团 2013 和生物化学杂志的指南）。免染技术满足了执行这些新方案的所有要求，并且被认为是提高蛋白免疫印迹准确性的有效策略（Ghosh et al.，2014）。

满足定量蛋白免疫印迹的期刊发表要求

质粒纯化试剂盒选择指南

试剂盒		DNA 产物	制备 时间	细菌培养 密度或体积	纯化 格式	结合 基质	生长 培养基
Aurum 质粒小型		>20µg	10 分钟	最多 12 OD • ml*	真空** 和旋转	二氧化硅 膜	标准品
Quantum Prep 微量制备		>20µg	15 分钟	1–10 ml	离心	硅藻 土	富集的 或标准的

 

* (未稀释培养物的 OD₆₀₀) x (以 ml 为单位的培养物体积) = OD •ml 的数量。1 OD ₆₀₀ 相当于大约 8 x 10⁸ 细胞/毫升。
** 使用 Aurum 真空歧管。