フローサイトメトリー：セルアナライザー vs セルソーター

フロ―サイトメーターの仕組み

フローサイトメトリーを行う機器を一般にフロ―サイトメーターを呼称します。前述の通り、フロ―サイトメーターには、分析のみを行うセルアナライザーと細胞分取まで行うセルソーターがあります。フローサイトメトリーでは加圧された液体により細胞（または粒子）を検出ポイントへ特別な方法で送り出し、通過する際にの物理的および化学的特性の測定を行います。

流路系システム

フローサイトメトリーの基本能力の1つとして、個々の粒子の性質を解析できることが挙げられます。サンプルがフローサイトメーターに入ると、サンプル中の粒子はサンプルラインの3次元空間にランダムに分布します。サンプルラインの直径はほとんどの細胞の直径よりも何倍も大きいため、それぞれの粒子を機器の検出系で解析できるような単一縦列の流れにする必要があります。このプロセスは流路系によって制御されます。
流路系はサンプルが注入される中心コアと、その外側を包むシース液によって形成されます。（ノズルまたはキュベット内で）シース液が細くなることにより流速が増します。サンプルはその中央に導入され、ベルヌーイ効果によって集束されます（Fig.1）。これにより、粒子が一列に並んだ流れを形成することができ、これを流体力学的絞込み(hydrodynamic focusing)と呼びます。最適条件下（Laminar flow, 層流と呼びます）では、中央のサンプル液とシース液は混ざり合いません。

サンプル検出

流体力学的集束後、各粒子は、集束光の1つまたは複数のレーザービームを通過します。各光源は、紫外線から遠赤色までの範囲の単一波長を有する。光源が粒子に照射された際の光散乱または蛍光発光（自家蛍光または粒子が蛍光標識されている場合）は、粒子の特性に関する情報を提供します。粒子からの散乱光の内、レーザー軸から最大20°オフセットして前方に散乱する光は、光電子増倍管（PMT）またはフォトダイオードによって検出される前方散乱（FSC）チャネルとして知られています（Fig.2）。このFSC測定により、小さい粒子よりも大きい粒子がより多くの光を屈折させるため、粒子サイズを推定できます。励起光源軸に対して90°の角度で測定された光は、側方散乱（SSC）と呼ばれます。 SSCは、細胞または粒子の相対的な複雑さ（例えば、粒度や内部構造）に関する情報を提供できます。 FSCとSSCはどちらも粒子ごとに固有であり、この2つの組み合わせを使用して、血液などの不均一な集団の細胞タイプを大まかに区別することができます。ただし、これはサンプルの種類とサンプル調製の品質に依存するため、より詳細な情報を取得するには、通常、蛍光標識が必要です。

Fig. 2 典型的なフロ―サイトメーターの光学検出系概略図。 FL:蛍光、PMT:光電子増倍管、SSC:側方散乱光、FSC:前方散乱光、青矢印:光路。

光学系と検出系

様々な波長で行われた蛍光測定は、蛍光標識された細胞表面受容体またはDNAやサイトカインなどの細胞内分子に関する定量的および定性的なデータを提供できます。ほとんどのフローサイトメーターは、放出された光を検出するために別々のチャネルと検出器を使用します。その数は、機器とメーカーによって異なります（Fig.2）。検出器は、PMTまたはフォトダイオード（APD）のいずれかです。 PMTは、最も一般的に使用される検出器です。

検出の特異性は、他の波長を透過しながら特定の波長をブロックする光学フィルターによって制御されます。フィルターには主に3種類があります。ロングパスフィルターは、カットオフ波長を超える光を透過させます。ショートパスフィルターは特定の波長未満の光を透過し、バンドパスフィルターは指定された狭い波長範囲（帯域幅と呼ばれる）内の光を透過します。また、ダイクロイックフィルターは、位相反射によって光を反射もしくは、特定波長の光が透過できるようにします。ダイクロイックフィルターは、対向する光に対して斜めに配置された場合のミラーでもあります。このタイプのフィルターは、2つの機能を実行できるようになりました。まず、特定の波長が順方向に通過できるようにします。第二に、それは90°の角度で光を反射することができます。これにより、光路を一連のフィルターに通すことができます。フィルタの正確な選択と順序は、複数の信号を同時に検出できるように調整できます。

電子処理系

粒子がインターロゲーションポイント（interrogation point:レーザー照射点）を通過するたびに、信号が発生し、すべての検出器でパルスが生成されます。 これらのパルスは、粒子が1つないし複数のレーザービームを通過し、通過した経路内の各点で生成された信号を反映します。 パルスの波形は時間の関数として信号をプロットすることによって描くことができます。粒子がレーザービームスポットに入ると、散乱光および蛍光信号を生成し、最終的にはPMTの陽極からの電流（電子の流れ）として検出されます。 電流の大きさはPMTの光電陰極に当たった光子の数に比例するため、電流値は粒子による散乱または蛍光信号の強度にも比例します。 粒子がレーザービームスポットに入ると、PMTの出力が上昇し始め、粒子がレーザービームの中央に位置するときに最大に達します(Fig.3)。粒子全体が照射された時点で、最大量の光信号を生成します。（レーザービームの焦点の中心が、最も光子密度が高い）。 そして、粒子がレーザービームから外れていくと、PMTの電流出力はベースラインに戻ります。 このようなパルス発生を「イベント」と呼びます。

Fig. 3 高さ、面積、幅を測定によるパルスの定量化

データの読出

パルスが生成されると、蛍光シグナルをプロットに表示し、分析し、解釈するために、それらの定量化が必要になります。これは、フローサイトメーターの電子処理系の機能です（Fig.4）。機器は、パルスの高さ、面積、幅を計算することにより、パルス全体を定量化します。高さと面積、または最大と積分は、それぞれ、信号強度の測定に使用されます。これは、それらの大きさがPMTと相互作用した光子の数に比例するためです。一方、幅は、粒子がレーザー通過時間に比例し、単一の粒子または密接に相互作用する粒子とダブレットを区別するために使用できます。

各検出器からの測定値は、パラメーターと呼ばれます。各パラメーターは、フローサイトメトリーソフトウェアのヒストグラムとドットプロットに高さ、面積、幅の値で表示できます。これを使用して、蛍光強度を測定し、集団を比較できます。この方法で数万個の細胞（フローサイトメーターによっては1秒あたり最大10万個の細胞でも）をすばやく検査できます。収集されたデータはコンピューターで処理され、サンプルの構成を分析する際に強力なツールになります。

Fig. 4 溶解した全血の分析結果； A. SSC vs. FSC density plot. B. SSC vs. CD45 PB 蛍光プロット。 PB:パシフィックブルー、FSC:前方散乱、 SSC:側方散乱

セルアナライザー vs. セルソーター

多くの共通機能と、１つの大きな違い

S3eセルソーター, （Fluorescence-Activated Cell Soter;蛍光活性化セルソーターまたは略してFACSと呼ばれる）のような液滴ベースのセルソーターは、最初に粒子を分析しますが、液滴を生成できるハードウェアと、必要な粒子をコレクションチューブに回収するための偏向または方向付ける手段も備えています（Fig.5）。液滴は、一定期間にわたって最適な振幅（ボルト単位）でノズルの高周波（サイクル/秒、Hz）振動を使用することによって形成できます。 これは通常、圧電結晶（ピエゾ素子）によって作成されます。細胞がレーザー照射点を通過すると、細胞から放出された光が検出器を介して検出され、この信号が機器の電子処理系によって処理され、機器に液滴に電荷を印加するように指示します。 帯電した液滴は、回収のために適切なチューブに偏向させることができます。 生細胞を選別することにより、in vivoおよびin vitroでのさらなる特性評価のための追加の実験的研究が可能になります。

Fig. 5 蛍光活性化セルソーティングは、各細胞の特定の光散乱と蛍光特性に基づいて、細胞の不均一な混合物を選別する特殊なタイプのフローサイトメーターです。

研究室に最適なセルソーターの選択

ベンチトップ型セルアナライザーは、より使いやすくコンパクトになったため、現在、研究室で一般的に見られますが、技術的に複雑で、学習曲線が急で、操作とメンテナンスに専任の担当者が必要なセルソーターの場合は必ずしもそうではありません。これは、関心のあるポピュレーションをソートするために2、3のパラメーターのみが必要な場合でも当てはまります。しかし、高速分析とセルソーティングが可能なバイオ・ラッドのS3eセルソーターなどの新世代機器は、はるかに使いやすく、セルソーターをご自身の研究室に持ち込むことができます。 S3eセルソーターのような自動セルソーターは、蛍光タンパク質を発現する細胞（eGFP、mCherryなど）の分離や、1つまたは2つの蛍光マーカーで標識された細胞（PE、FITCなど）などの単純なソートに最適です。それらのより洗練され、簡単化されたセルソーターは、独自の機器として、各研究室または共通機器施設にあるより複雑なセルソーターの貴重なサポート役として使用できます。また、ソーティングの追加機能により、これらのセルソーターは、シングルセル分析やCRISPRゲノム編集などの下流の研究で使用するために、細胞の分析と分離の両方に使用できます。

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