Large and Small Molecule Screening by SPR

La technologie de résonance plasmonique de surface (SPR) fournit des données sur l’affinité, la spécificité et la cinétique des interactions biomoléculaires en temps réel sans nécessiter d’étiquettes, ce qui en fait un outil idéal pour une utilisation tout au long du processus de développement de médicaments. Pour appliquer efficacement la technologie SPR à la découverte et au développement de drogues, la plateforme SPR doit être rapide, rentable et adaptée à un débit élevé.

Le système ProteOn XPR36, un nouveau biocapteur SPR doté d’un tableau d’interactions de 6 x 6, est un outil idéal pour le dépistage des interactions biomoléculaires dans le développement de médicaments. Le système ProteOn XPR36 permet l’injection simultanée de six ligands et six analytes, créant un tableau d’interaction de 6 × 6 qui permet une flexibilité dans la conception du dosage et une optimisation expérimentale rapide. Grâce au système ProteOn XPR36, le dépistage des composés actifs du plomb et des agents biologiques passe d’analyses en série répétitives à des analyses parallèles simultanées, ce qui permet d’obtenir des résultats plus rapides avec le même niveau de précision que les tests de liaison traditionnels.

Les anticorps monoclonaux sont de plus en plus utilisés dans la recherche médicale, la science de base et le diagnostic et le traitement des maladies. Le SPR joue un rôle important dans le dépistage et la caractérisation des anticorps, fournissant une variété de données utiles telles que l’affinité des anticorps, la cartographie des épitopes et la spécificité de liaison. Le SPR peut également être utilisé pour évaluer la réactivité croisée des anticorps dans les tests multiplex. Contrairement aux tests de critères d’évaluation traditionnels tels que ELISA, la technologie SPR surveille la liaison en temps réel et peut analyser les phases d’association et de dissociation d’une interaction, permettant la détection d’événements de liaison faible qui seraient autrement difficiles à caractériser.

Le système ProteOn XPR36 offre un avantage distinct par rapport aux autres plates-formes SPR en facilitant l'approche de la cinétique en un clic, le dépistage cinétique rapide des cibles d'anticorps avec une seule injection d'analyte (antigène). Les constantes cinétiques d'une seule interaction anticorps-antigène peuvent être obtenues par l'injection simultanée d'une série de concentration complète d'analytes sans avoir à régénérer la surface du ligand, contrairement aux instruments SPR traditionnels qui ne permettent que des injections séquentielles (Bravman et al. 2006).

Une nouvelle méthode a été développée pour augmenter davantage le débit du dépistage cinétique sur le système de matrice d’interaction de la protéine ProteOn XPR36. À l’aide d’un protocole d’immobilisation par étapes, 36 cibles différentes sont immobilisées sur une seule puce ProteOn pour former un tableau pour le dépistage à haut débit. Dans cet exemple, la puce du capteur ProteOn est fonctionnalisée avec 36 protéines cibles uniques, permettant l'acquisition de données de dépistage cinétique riches en informations de manière à haut débit (Abdiche et al. 2011). Ce tableau 36 x 1 permet aux chercheurs de dépister simultanément les analytes contre 36 cibles d’intérêt différentes, permettant ainsi une comparaison rapide entre un grand nombre d’interactions.

Utilisation du système ProteOn XPR36 pour caractériser les anticorps monoclonaux d’origine humaine
Contre le virus de la grippe
Présenté par Lisa Scalfone, PhD (Stanford University School of Medicine)

Dépistage et sélection des anticorps monoclonaux anti-Clostridium à l’aide du système ProteOn XPR36
Présenté par Carlotta Chiappa, PhD (DiaSorin Research Center, Italie)

ProteOn XPR36 et Lipoparticle Technology, une combinaison puissante pour le dépistage des anticorps thérapeutiques contre les protéines membranaires
Présenté par Sharon Willis, PhD (Integral Molecular, États-Unis)

Amélioration du débit du biocapteur ProteOn dans les applications de dépistage des anticorps
Présenté par Kevin Lindquist (Pfizer Rinat, États-Unis)

Les évaluations qualitatives de liaison peuvent être utilisées pour classer l’affinité relative des anticorps pour différentes cibles, cartographier ou définir les épitopes de bacs et définir les relations structure-activité pour les petites molécules. Les résultats de liaison oui/non obtenus à partir de l’analyse SPR des interactions biomoléculaires peuvent être utilisés pour corréler la liaison avec une propriété particulière d’analyte/ligand ou pour évaluer la réactivité croisée avec différentes biomolécules. Le dépistage des anticorps contre les antigènes porteurs de mutations dirigées vers le site peut aider à cartographier les épitopes et à améliorer la conception des anticorps (Bravman et al. 2009). Des dosages de liaison compétitifs tels que le dosage sandwich classique peuvent être utilisés pour déterminer si différents anticorps reconnaissent le même épitope ou différents sur un antigène, un processus appelé binning des épitopes (Abdiche et al. 2011, Abdiche 2009).

Représentation des résultats de la cartographie des épitopes. Les anticorps 1 et 2 partagent les mêmes épitopes ou se chevauchent, tout comme les anticorps 7a et 7b. Cependant, l’épitope reconnu par les anticorps 1 et 2 est différent de celui reconnu par les anticorps 7a et 7b.

En plus d'évaluer facilement la liaison oui/non, le logiciel ProteOn Manager™ intégré et facile à utiliser accélère encore l'évaluation qualitative des interactions biomoléculaires en rationalisant l'analyse des données.

Webinaires traitant de diverses applications relatives au classement avec le système ProteOn XPR36 :

Fixation des épitopes à l’aide du ProteOn XPR36
Présenté par Yasmina Abdiche, PhD (Pfizer Rinat, États-Unis)

ProteOn XPR36 et Lipoparticle Technology, une combinaison puissante pour le dépistage des anticorps thérapeutiques contre les protéines membranaires
Présenté par Sharon Willis, PhD (Integral Molecular, États-Unis)

Caractérisation des anticorps à l’aide du système ProteOn XPR36, un biocapteur SPR multiplexé
Présenté par Hassan Issafras, PhD (XOMA, États-Unis)

Une étape importante de la découverte de drogues est le dépistage de grandes bibliothèques de petites molécules pour l’affinité et l’activité contre une cible protéique. Les dosages à haut débit de petites molécules avec des temps de développement courts sont essentiels pour identifier les petites molécules actives à partir de grandes bibliothèques de composés. La technologie SPR peut être extrêmement précieuse dans la découverte de drogues à petites molécules, car elle fournit des données d'activité et de spécificité qui permettent le classement quantitatif des composés de plomb. Étant donné que les bibliothèques de petites molécules peuvent avoir une taille allant de milliers à des millions de composés, les plates-formes qui accélèrent le délai d'obtention des résultats sont hautement souhaitables à ce stade. Les dispositifs SPR conventionnels n’ont pas un débit suffisant pour répondre à ce besoin et sont souvent utilisés en tant que technologie conformationnelle en conséquence.

Les capacités à haut débit du système ProteOn produisent des données SPR de haute qualité en peu de temps. Cette combinaison fait du système ProteOn un outil puissant pour le dépistage des petites molécules (Bronner et al. 2010, Miura et al. 2010, Tabul et al. 2010).

Des tracés Sensorgram dans des études cinétiques de la CAII (20 000 RU) et d'un inhibiteur.

En outre, les résultats de référencement simultanés et en temps réel du système ProteOn dans une ligne de base hautement stable qui permet une détection précise des interactions de petites molécules. L’analyse de la cinétique de liaison pour des molécules aussi petites que 95 daltons est possible avec la puce de capteur ProteOn GLH, la première puce de capteur à haute densité spécialement conçue pour la détection de petites molécules et les mesures cinétiques (Turner et al. 2008).

Webinaires traitant de divers aspects du dépistage des petites molécules avec le système ProteOn XPR36 :

Exploration de la cinétique en un clic et de l’analyse de petites molécules sur le système ProteOn
Présenté par David Myszka, PhD (Université de l’Utah)

Analyse sans marquage de petites molécules et de peptides se liant aux liposomes
Présenté par Dalia Shezifi, PhD (Bio-Rad Laboratories)

Abdiche YN et al. (2009). Exploration des tests de blocage à l’aide des biocapteurs Octet, ProteOn et Biacore. Anal Biochem 386, 172–180. PMID: 19111520
Les auteurs démontrent l’utilisation de biocapteurs optiques en temps réel sans étiquette dans des tests de liaison compétitifs en binnant un panel d’anticorps. Trois configurations de dosage (blocage en tandem, prémélange et sandwich classique) ont été chacune mises en œuvre sur trois plateformes, le système Octet QK de ForteBio, le système ProteOn™ XPR36 de Bio-Rad et le système Biacore 3000 de GE Healthcare. Des profils de blocage ont été obtenus pour chaque anticorps par rapport aux autres dans le panel pour créer des bacs d’anticorps avec des épitopes similaires. Les avantages et les inconvénients de chaque biocapteur sont abordés avec des facteurs à prendre en compte dans la sélection d’une configuration de dosage de blocage appropriée pour un système d’interaction particulier et des conseils pour traiter les données ambiguës.

Abdiche YN et al. (2011). L’expansion du biocapteur ProteOn XPR36 dans un réseau de 36 ligands accélère l’analyse des interactions protéiques. Anal Biochem 411, 139–151. PMID: 21168382
Cet article décrit en détail comment créer un réseau de 36 ligands pour le dépistage des anticorps. Cette nouvelle utilisation du système ProteOn™ permet l'immobilisation de 36 ligands individuels à la surface du réseau. Dans ce dosage, 36 cibles d'anticorps du même antigène ont été analysées à l'aide de la méthode sandwich classique, et le regroupement et la cartographie des épitopes ont été effectués. Toutes ces expériences ont été effectuées sur une seule puce de capteur ProteOn en environ une journée.

Bravman T et al. (2006), Exploration de la « cinétique en un seul clic » et analyse de petites molécules à l’aide du biocapteur en réseau ProteOn XPR36. Anal Biochem 358, 281–288. PMID: 16962556
Cet article décrit l'utilisation du biocapteur ProteOn™ XPR36 en réseau parallèle pour caractériser la cinétique de liaison d'un ensemble d'interactions entre petites molécules et enzymes. À l’aide du système de passage croisé du flux du système ProteOns, les auteurs ont recueilli des données de réponse pour six concentrations différentes de chaque analyte sur six surfaces de protéines cibles différentes. Cette approche « en un clic » de l’analyse cinétique améliore considérablement le débit tout en générant des données de haute qualité, même pour les analytes à faible masse moléculaire. La dépendance thermique de la cinétique pour quatre des interactions inhibiteur-enzyme a également été déterminée dans la plage de 15 à 35 °C. Ces résultats illustrent le potentiel de ce nouveau biocapteur à traitement parallèle pour accroître la vitesse de l’analyse cinétique dans la découverte de médicaments et étendre les applications des matrices d’interaction protéique en temps réel.

Bravman T et al. (2009). Dépistage, classement et cartographie épitopique du surnageant anti-IL-9 humain. Bulletin 5540 de Bio-Rad.
Le système ProteOn™ a été appliqué à la sélection, au classement et à la cartographie des épitopes de 20 surnageants d'Ac monoclonaux. L’anticorps anti-souris a été utilisé pour capturer les anticorps des surnageants, et l’analyte IL-9 a été injecté sur cette surface pour analyser les interactions de l’Ag-Ac. Le débit du système a été exploité en capturant cinq ligands différents en parallèle et en déterminant les constantes cinétiques de liaison en une seule injection de cinq concentrations d'analyte. Quatre échantillons d’anticorps ont été purifiés, puis une cartographie des épitopes a été effectuée.

Bronner V et al. (2010). Développement et optimisation rapides de dosage pour la découverte de drogues à petites molécules. Bulletin 5797 de Bio-Rad.
Ce rapport décrit comment le système ProteOn™ a été appliqué pour établir rapidement un dosage de dépistage et de caractérisation de petites molécules à l'aide de l'approche Cinétique™ en une seule injection. Le système de modèle se composait d’un composé de plomb putatif Y et d’un domaine protéique de sa protéine cible PDX. Le dosage de dosage et d’analyse a été significativement réduit par le tableau d’interaction à haut débit 6 × 6. Une immobilisation protégée par ligand a été employée pour immobiliser le ligand sur la surface de la puce du capteur avant son analyse avec l’analyte. Cette approche a permis de s’assurer que le ligand était immobilisé dans son orientation active.

Hosse RJ et al. (2009). Dépistage cinétique des conjugués antibody-Im7 par capture sur un domaine de la colicine E7 DNase à l’aide de biocapteurs optiques. Anal Biochem 385, 346–357. PMID: 19073134
L’interaction à haute affinité entre un domaine de nucléase d’origine naturelle de l’E. coli colicine E7 (DNaseE7) et son partenaire apparenté, la protéine d’immunité 7 (Im7), a été exploitée dans le développement d’un système de capture de ligand pour les biocapteurs basés sur la résonance plasmonique de surface afin de permettre un classement cinétique précis des clones de bibliothèque dans la génération d’anticorps par affichage phagique. La méthode est généralement applicable à une gamme de formats d’anticorps : anticorps scFv, diabodies, fragments de liaison à l’antigène (Fabs) et anticorps monodomaine VNAR de requin. Une caractéristique clé de ces tests est la capture stable et réversible de fragments d'anticorps à partir d'échantillons bruts, entraînant une analyse cinétique à haute résolution des résultats de la bibliothèque.

Miura T et al. (2010). Profilage haut débit de la sélectivité des inhibiteurs de kinase à l'aide du système de matrice d'interaction de la protéine ProteOn™ XPR36. Bulletin 5960 de Bio-Rad.
Les auteurs décrivent l’utilisation de l’approche cinétique en une seule injection avec le système ProteOn pour générer des valeurs de KD pendant le dépistage des inhibiteurs de kinase à petites molécules contre cinq cibles kinases importantes connues. Les kinases biotinylées et une ATPase ont été immobilisées et une série de concentration des inhibiteurs a été injectée. Le dosage a été évalué à l’aide d’une analyse du facteur Z’, et il a été démontré qu’un Rmax de 17 RU était suffisant pour obtenir des résultats cohérents.

Rich RL et Myszka DG (2011). Étude de la littérature commerciale 2009 sur les biocapteurs optiques.  Mol Recognit 24, 892–914. PMID: 22038797
La littérature commerciale sur les biocapteurs en 2009 a été examinée par 22 utilisateurs de biocapteurs qui ont défini les critères de leurs attentes dans une publication et ont finalement décidé d’utiliser un système de réussite/échec pour sélectionner les articles à inclure dans la liste de référence de cette année. Sur les 1 514 publications en 2009 qui ont indiqué utiliser la technologie de biocapteur optique disponible sur le marché, seulement 20 % ont dépassé leur seuil. Ils ont sélectionné dix articles pour mettre en évidence une bonne technique expérimentale, une présentation des données et des applications uniques de la technologie.

Tabul M et al. (2010). Dépistage rapide et à haut débit des inhibiteurs de protéine kinase à l'aide du système de matrice d'interaction des protéines ProteOn™ XPR36. Bulletin 5965 de Bio-Rad.
Ce document décrit l’optimisation rapide des conditions d’immobilisation pour les cibles de protéine kinase afin de garantir que la protéine immobilisée reste dans un état actif. Des composés provenant de deux bibliothèques d’inhibiteurs de kinases à petites molécules ont été analysés contre chaque cible kinase afin d’identifier les résultats de liaison. Une analyse cinétique détaillée des composés de liaison positifs a été effectuée pour déterminer les constantes de liaison. Le dépistage de 110 composés n’a pris que 5 heures et tous les travaux ont été effectués sur une seule puce de capteur GLH.

Turner B et al. (2008). Applications de la puce du capteur ProteOn™ GLH : Interactions entre les protéines et les petites molécules. Bulletin 5679 de Bio-Rad.
Ici, le système ProteOn a été utilisé pour étudier l’interaction entre l’isoenzyme de l’anhydrase carbonique (IIAC) et une série d’inhibiteurs connus de sulfamides à petites molécules. Les résultats du dépistage cinétique ont été obtenus avec une efficacité élevée en utilisant l'approche cinétique en un clic. L’expérience a mesuré la liaison d’un inhibiteur de méthylsulfonamide de 95-dalton au ligand CAII, montrant la haute sensibilité du système ProteOn pour l’analyse des interactions de petites molécules. En outre, les performances de la puce du capteur GLH en termes d’immobilisation du ligand et d’analyse d’interaction ont été étudiées avec trois modèles d’interactions protéine-petite molécule : Inhibiteurs de la CA II-sulfamide, AA marqués aux AcM anti-DNP et ASH-digitoxine. Les résultats vérifient que la puce du capteur GLH est un choix idéal pour l'analyse des interactions lorsqu'une sensibilité maximale est souhaitée.

Rich RL et Myszka DG (2000). Avancées dans l’analyse du biocapteur de résonance plasmonique de surface. Curr Opin Biotechnol 11, 54–61. PMID: 10679342
Cet article de revue décrit en détail comment concevoir des expériences SPR et analyser les données SPR pour produire des données cinétiques de haute qualité, en mettant particulièrement l’accent sur les stratégies de réduction de l’influence du transfert de masse et du référencement et du masquage appropriés des données cinétiques. Les données d’échantillons pour les interactions de liaison faible signal-bruit montrent comment un référencement et un masquage appropriés des données peuvent permettre la détection d’événements de liaison faible ou d’interactions avec de petites molécules.

Yousef M (2007). Avancées dans le dépistage rapide des anticorps monoclonaux. Am Biotechnol Lab 25, 26–28.
Cet article décrit une méthode alternative pour le dépistage rapide des anticorps monoclonaux à l'aide du SPR multiplexé et de l'approche cinétique en une seule injection du système de matrice d'interaction de la protéine ProteOn™ XPR36. Le système ProteOn a été utilisé pour dépister les surnageants afin d’identifier les candidats AcM à haute affinité contre l’IL-12 humaine et l’hémoglobine E. Plus de 250 surnageants ont été dépistés en 12,5 heures dans une expérience, à l’aide d’une puce de capteur unique. Il n’était pas nécessaire de purifier les anticorps des surnageants avant l’analyse.