Surveillance de la COVID-19
Surveillance
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Test des eaux usées | Pooling | Contrôle de surface | Quantification absolue |
La surveillance de la COVID-19 est nécessaire pour prendre des décisions sanitaires plus éclairées. Cependant, les grandes quantités d'échantillons, les pénuries d'équipement et la complexité des échantillons font obstacles à ces efforts. Le test SARS-CoV-2 Droplet Digital PCR (ddPCR) de Bio-Rad surmonte une grande partie de ces difficultés : il excelle dans la détection de petites quantités d'ARN viral dans des échantillons biologiques complexes, rend possible le test ultrasensible des échantillons mis en commun et utilise des consommables différents des autres tests d'acide nucléique. Pour intensifier les efforts de surveillance de la COVID-19, Bio-Rad a développé un protocole sans extraction offrant des délais de traitement plus rapides tout en réduisant le coût par test de manière significative.
Test des eaux usées
Le test des eaux usées peut être utilisé pour détecter l'ARN viral SARS-CoV-2 excrété dans les selles des personnes infectées symptomatiques et asymptomatiques, offrant ainsi une surveillance presque en temps réel de la contagion virale du SARS-CoV-2 au sein de la communauté. Ce test donne un meilleur aperçu de la contagion au sein d'une communauté que les tests cliniques et peut servir de système d'avertissement précoce des épidémies de COVID-19.
De grandes quantités d'inhibiteurs de PCR combinées à de faibles abondances de virus compliquent l'analyse des eaux usées avec des tests d'acide nucléique traditionnels. L'essai SARS-CoV-2 ddPCR de Bio-Rad surmonte ces obstacles en offrant une alternative ultrasensible tolérante aux inhibiteurs de PCR. La technologie ddPCR de Bio-Rad est utilisée pour anticiper et prévenir l'émergence de la COVID-19 dans les communautés.
32 %
des personnes infectées
par le SARS-CoV-2
vont consulter un médecin1
LA PRÉSENCE DE SARS-CoV-2 :
6 jours4
avant le test clinique
personne infectée sur 10 0005
$$$
INFECTION
communauté
Bibliographie
- Silverman JD et al. (2020). Using influenza surveillance networks to estimate state-specific prevalence of SARS-CoV-2 in the United States. Science Translational Medicine, 12(554), eabc1126
- Wei WE et al. (2020). Presymptomatic Transmission of SARS-CoV-2 - Singapore, January 23-March 16, 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report, 69(14), 411–415
- Garg S et al. (2020). Hospitalization Rates and Characteristics of Patients Hospitalized with Laboratory-Confirmed Coronavirus Disease 2019 - COVID-NET, 14 States, March 1-30, 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report, 69(15), 458–464
- Medema G et al. (2020). Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in Sewage and Correlation with Reported COVID-19 Prevalence in the Early Stage of the Epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters, acs.estlett.0c00357
- Hart OE & Halden RU. (2020). Computational analysis of SARS-CoV-2/COVID-19 surveillance by wastewater-based epidemiology locally and globally: Feasibility, economy, opportunities and challenges. Science of the Total Environment, 730, 138875
Une récente étude (Gonzalez 2020) a, pendant plusieurs mois, employé la technologie ddPCR pour dépister l'excrétion virale du SARS-CoV-2 dans des échantillons d'eau usée prélevés chaque semaine issus de neuf centres de traitement. Des niveaux accrus d'ARN de SARS-CoV-2 dans les eaux usées étaient prédictif d'une hausse du nombres de cas confirmés, mettant ainsi en avant la capacité de la surveillance des eaux usées à identifier les épidémies virales dans les municipalités avant même qu'elles ne se produisent.
Les tests des eaux usées peuvent également être utilisés par l'industrie du transport pour surveiller la transmission de SARS-CoV-2 entre les personnes qui voyagent en avion ou en bateau. L'analyse ddPCR de Bio-Rad détecte plus fréquemment l'ARN viral SARS-CoV-2 faiblement représenté, notamment dans les eaux usées d'avions, que toute autre technologie (Ahmed 2020).
Alors que les universités ouvrent à nouveau leurs portes, les laboratoires académiques commencent à employer les tests des eaux usées pour éviter toute éruption de la COVID-19.
Apprenez ce que font les scientifiquesPooling
Le nombre de tests requis pour la surveillance de la COVID-19 peut être réduit grâce au pooling des échantillons. Il existe deux types de pooling : le pooling hiérarchique et le pooling basé sur une matrice.
Le pooling hiérarchique implique le test de plusieurs échantillons dans une même réaction. Un résultat négatif indique que tous les échantillons du mélange sont négatifs. Un résultat positif requiert que tous les échantillons individuels du mélange soient testés à nouveau pour identifier les échantillons positifs. Le nombre d'échantillons dans chaque mélange doit être maintenu à un minimum pour éviter des taux élevés de nouveaux tests. Idéalement, le taux de positivité devrait être inférieur à 5 % pour que le dépistage sur mélange d'échantillons soit efficace. Le tableau ci-dessous illustre la manière dont le pooling hiérarchique peut réduire le nombre de tests requis lors de l'utilisation du système QX ONE automatisé de Bio-Rad.
| Prévalence attendue de la maladie | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| — | |||||
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| 2% | |||||
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Tableau généré en utilisant un outil de calcul du pooling .
Le pooling basé sur la matrice est plus compliqué, cependant, il peut permettre d'éviter de nouveaux tests. Ici, les échantillons sont déployés dans une matrice et groupés par lignes et par colonnes. Lorsque seule une ligne et une colonne sont positives, les échantillons positifs peuvent être identifiés comme intersection de ces groupes dans la matrice. Si plusieurs lignes et colonnes sont positives, les groupes positifs doivent être à nouveau matricés pour un nouveau test. Globalement, cette méthode réduit le nombre de tests de moitié par rapport aux essais individuels (Ben-Ami 2020).
Le dépistage sur mélange d'échantillons, lorsqu'il n'est pas utilisé pour indiquer des résultats spécifiques aux patients, ne requiert pas de laboratoire accrédité pour le diagnostic, car les résultats sont publiés sous forme d'agrégats et non sous forme individuelle. Cela peut réduire davantage les coûts en éliminant la nécessité du test de suivi des échantillons positifs.
Contrôle de surface
Le contrôle de surface fournit des informations essentielles sur la propagation du SARS-CoV-2 sur le lieu de travail, à l'école et dans les laboratoires d'analyse. Ces efforts peuvent informer les décisions liées à la santé publique sur les meilleures pratiques en matière de distanciation physique dans les zones communales. Il peut également constituer une importante mesure du contrôle de la qualité dans les laboratoires d'analyse pour s'assurer que les résultats des tests ne sont pas faussés par la contamination.
Protocole sans extraction
Bio-Rad a récemment développé un workflow ddPCR sans extraction capable de détecter 3,9 copies d'ARN de SARS-CoV-2 par microlitre dans des échantillons de surfaces environnementales. En éliminant le besoin d'extraction de l'ARN, le protocole sans extraction réduit de manière efficace les coûts et les délais des tests de SARS-CoV-2. En utilisant ce protocole, 96 échantillons peuvent être préparés pour la ddPCR en seulement 30 minutes.
Lire la note d'application (PDF 262 KB)
Pistage de la contamination en laboratoire
La haute sensibilité des tests de l'acide nucléique de la COVID-19 les rend susceptibles à la contamination croisée. Les acides nucléiques contaminants proviennent principalement des échantillons cliniques, des témoins positifs synthétiques et des produits d'amplifications PCR. De mauvaises habitudes opérationnelles peuvent mener au dépôt d'acides nucléiques contaminants sur l'équipement de protection du personnel, les poignées de porte et l'équipement de laboratoire à des niveaux allant de 14,7 copies/cm2 à 37,4 copies/cm2 (Lv 2020). Par ailleurs, un contrôle qualité inapproprié des réactifs de test peut générer de faux positifs.
Dr. Jim F. Huggett et ses collègues (Hugget 2020) ont exposé plusieurs actions qui peuvent être prises pour atténuer la contamination croisée dans les laboratoires de test :
- Contrôle qualité des réactifs du kit de test avant son utilisation
- Utiliser des témoins négatifs appropriés (par ex. : réactions négatives à la transcriptase inverse, blancs d'extraction et contrôles négatifs )
- Tester chaque échantillon pour la présence de plusieurs cibles SARS-CoV-2
- Séparer physiquement la manipulation des échantillons et la préparation de la PCR
Les procédures fréquentes de contrôle de surface et de désinfection approfondie peuvent être employées pour cibler et éliminer la contamination croisée. Capable de détecter des contaminants de faible niveau, le test ddPCR pour la détection de la présence de SARS-CoV-2 offre une solution robuste de contrôle de surface. Le protocole sans extraction de Bio-Rad et le système QX ONE automatisé peuvent être combinés pour empêcher le test de contaminer les habitudes opérationnelles en offrant un système tout-en-un de détection de la présence de SARS-CoV-2 et du contrôle qualité à utiliser en laboratoire.
Analyse quantitative absolue
La technologie ddPCR effectue une analyse de quantification absolue et ultrasensible de l'acide nucléique en fractionnant les échantillons en gouttelettes microscopiques. Chacune de ces gouttelettes abrite sa propre réaction PCR capable de détecter une unique molécule d'ADN. En raison de sa capacité d'analyse de quantification absolue, la technologie ddPCR est devenue la première procédure de mesure de référence de l'acide nucléique à être acceptée par le Joint Committee on Traceability in Laboratory Medicine (Comité mixte pour la traçabilité en médecine de laboratoire).
Dans le cas de la surveillance de la COVID-19, l'analyse de quantification absolue est essentielle pour détecter la présence de SARS-CoV-2 dans des échantillons de surface et d'eaux usées en faible quantité. L'analyse de quantification absolue facilite la prise de décisions liées à la santé publique en rendant possible la comparaison directe de différents types d'échantillons d'un laboratoire à l'autre.
De récents tests de détection de la présence de SARS-CoV-2 réalisés par le professeur Niels Pallisgaard (Department of Pathology, Zealand University Hospital) illustrent la reproductibilité de la technologie ddPCR sur plusieurs protocoles, dont un test à façon ciblant les gènes N1 et RdRp du SARS-CoV-2, ainsi que le gène humain B2M en utilisant des workflows à une ou deux étapes, ainsi que le test ddPCR en une étape de Bio-Rad (gènes N1 et N2). Ces résultats montrent que les essais ddPCR en une étape peuvent réduire les coûts et les efforts des tests ddPCR sans sacrifier la sensibilité. Ils montrent également que des résultats similaires peuvent être obtenus en utilisant différentes stratégies de ciblage du virus (N1/N2 vs N1/RdRp).
Détection de la présence de SARS-CoV-2 — Comparaison entre le kit SARS-CoV-2 de Bio-Rad et un kit à façon SARS-CoV-2 en utilisant le kit one step RT-ddPCR évoluée RT-ddPCR en 1 étape ou le kit RT-ddPCR en 2 étapes
ddPCR vs autres technologies
La technologie ddPCR peut infailliblement détecter la présence du virus dans des échantillons contenant de faibles quantités. Dans des tests de SARS-CoV-2 menés côte à côte sur 8 sets amorce/sonde différents, la technologie ddPCR est capable de distinguer de vrais négatifs des positifs à des dilutions minimales (10-4) de manière plus efficace que d'autres technologies tout en réduisant le taux de faux positifs (Liu 2020). La technologie ddPCR génère également moins de variations entre les réplicats à différents niveaux de dilution.
Le prélèvement et la manipulation des échantillons de SARS-CoV-2 peuvent avoir un impact sur la sensibilité des tests de diagnostic. Les pratiques de collecte et de gestion suboptimales par exemple peuvent se traduire par du matériel d'analyse insuffisant ou l'introduction de substances inhibant la PCR. Bien que l'impact des substances perturbatrices puisse être atténué en diluant les échantillons, cela réduit également la quantité de matière virale. La technologie ddPCR est plus efficace que d'autres technologies lorsque la quantité d'acides nucléiques est faible, faisant des tests ddPCR une option privilégiée dans les efforts de surveillance de la COVID-19.
La technologie facilite la comparaison des résultats diagnostics entre les laboratoires. Un webinaire récent (Bureau international des poids et mesures) a mis en évidence la capacité de la technologie de ddPCR à générer des résultats de diagnostic cohérentes dans les échantillons cliniques avec celle d'autres technologies. La technologie ddPCR a produit des mesures de SARS-CoV-2 comparables à partir du même échantillon d'un laboratoire à l'autre.
dMIQE 2020
Les décisions sanitaires liées à la pandémie de la COVID-19 reposent sur des données comparables d'un laboratoire à l'autre et d'un type d'échantillon à l'autre. Cependant, garantir une telle chose ne sera pas facile avec des méthodes conventionnelles. La haute reproductibilité de la technologie ddPCR contribue à la fiabilité du test en donnant la préférence aux méthodes existantes et en tant que méthode d'analyse à part entière. Privilégier ces efforts constitue les directives du Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments (dMIQE), qui ont été récemment mises à jour par le Dr Jim F. Huggett et le groupe dMIQE. Les directives dMIQE de 2020 décrivent les considérations principales à prendre en compte pour concevoir et analyser les tests ddPCR. Ces directives faciliteront la normalisation des mesures d'un laboratoire à l'autre et d'un type d'échantillon à l'autre lors de l'utilisation de la technologie ddPCR pour la surveillance de la COVID-19.
Selon le Dr. Jim F. Huggett, « La PCR digitale est de plus en plus reconnue comme une méthode moléculaire de haute précision capable d'être exécutée avec une reproductibilité inégalée. La dernière version des directives dMIQE a pour objectif de garantir que le potentiel de la méthode est maximisé. Ceci est particulièrement pertinent avec l'épidémie de COVID-19 où la dPCR est déjà utilisée pour comprendre la façon dont nous pouvons améliorer la reproductibilité du test moléculaire de SARS-CoV-2 à travers le monde ».
Kit Droplet Digital PCR (ddPCR) SARS-CoV-2
Bio-Rad a obtenu une autorisation d'utilisation d'urgence (Emergency Use Authorization – EUA) pour son test ddPCR pour la détection de la présence de SARS-CoV-2 le 1er mai 2020. Ce test détecte deux régions du gène nucléocapside de SARS-CoV-2 (N) (N1 et N2) ainsi que le gène humain RPP30.
Bibliographie
Ahmed W, Bertsch P, Angel N, et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in commercial passenger aircraft and cruise ship wastewater: a surveillance tool for assessing the presence of COVID-19 infected travellers. Jour of Travel Medicine. 2020;27(5). DOI:10.1093/jtm/taaa116
Ben-Ami R, Klochendler A, Seidel M, et al. Large-scale implementation of pooled RNA extraction and RT-PCR for SARS-CoV-2 detection. Clin Microbiol Infect. 2020;26(9):1248-1253. DOI:10.1016/j.cmi.2020.06.009
Gonzalez R, Curtis K, Bivins A, et al. COVID-19 surveillance in Southeastern Virginia using wastewater-based epidemiology. Water Research. 2020;186:116296. DOI: 10.1016/j.watres.2020.116296
Huggett J, Benes V, Bustin S, et al. Cautionary note on contamination of reagents used for molecular detection of SARS-CoV-2. Clin Chem. hvaa214. DOI:10.1093/clinchem/hvaa214
Liu X, Feng J, Zhang Q, et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 2020;9(1):1175-1179, DOI: 10.1080/22221751.2020.1772679
Lv J, Yang J, Xue J, et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR [published online ahead of print, 2020 Jun 19]. Sci of the Total Environ. 2020;742:140370. DOI:10.1016/j.scitotenv.2020.140370
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